II. Description de l’accident et aide au diagnostic
L’utilisation d’analyses et de tests de terrain (niveau 2) permet de confirmer le diagnostic sur les causes de contamination à l’origine de l’accident en utilisant l’aide au diagnostic de premier niveau. Ce deuxième niveau de diagnostic peut aussi être utilisé en cas de non résolution avec le premier niveau de diagnostic.
Des précautions (conservation, transport...) doivent être prises lors de prélèvements de lait, de fromages pour analyses microbiologiques. Pour plus d’informations, nous vous conseillons la fiche correspondante située dans les annexes générales du guide.
Il a été montré que la contamination de l’eau était cyclique et pour cette raison il vous est conseillé de faire un prélèvement sur 5 jours. Pour cela, il faut fournir au producteur 5 flacons sur lesquels vous aurez marqué au feutre indélébile le jour et la date du prélèvement. Des essais ont montré qu’il n’était pas nécessaire de prélever 1 litre d’eau car la filtration au laboratoire est longue et cela se traduit alors par des résultats faux négatifs.
Deux situations se présentent :
Tous les fromages sont jaunes, la coloration est intense. Dans ce cas, il faut prélever 10 ml d’eau dans un flacon stérile (flacon à large ouverture). Ce volume sera filtré sur une membrane millipore de 45 microns.
Quelques fromages sont contaminés avec une coloration à peine visible. Dans ce cas, il faut prélever 100 ml d’eau.
En effet, quand l’eau est très chargée, les colonies se touchent et l’interprétation de la boite est délicate avec un risque de conclure à des faux négatifs. L’eau doit être prélevée au robinet qui alimente la fromagerie et au niveau de celui qui alimente la salle de traite, surtout si les canalisations souterraines sont bien différenciées.
Il faut s’attendre à des résultats hétérogènes sur les 5 prélèvements consécutifs. Il n’est pas étonnant d’avoir certains jours des résultats négatifs. Il est utile de se renseigner sur la nature de l’eau, le type de captage et la distribution. Parfois l’examen à l’oeil nu de la turbidité donnera une bonne indication sur l’état du captage et du stockage.
Il n’est pas nécessaire d’indiquer au laboratoire les dilutions décimales car le résultat sera exprimé sur 10 ou 100 ml. Il n’y a pas de dilution mais filtration et dépôt de la membrane sur le gélose. La détection de Pseudomonas dans 1 ml d’eau est suffisante pour s’occuper particulièrement de la qualité de l’eau.
Il faut prélever le lait de mélange d’une seule traite lorsque c’est possible. On peut remplacer le lait de la traite par le lait avant emprésurage. Dans ce cas, il faut tenir compte du récipient de stockage du lait et du temps qui s’est écoulé entre la fin de la traite et ’emprésurage. Il est aussi possible de prélever le lait en fin de maturation. Il faut noter que c’est ici une pratique à risque car elle permet aux Pseudomonas de se développer en même temps que les bactéries lactiques. Si la maturation est faite par l’ajout de lactosérum, il est judicieux de prélever aussi le lactosérum.
Il a été montré que cette contamination pouvait être cyclique. En conséquence, 5 prélèvements consécutifs sont proposés. Cela peut correspondre à 5 jours consécutifs ou à 5 traites consécutives (matin, soir, matin, soir, matin) : 30 ml de lait sont suffisants.
Il faut indiquer au laboratoire les dilutions décimales car il ne sait pas à priori le niveau de contamination. Il est conseillé de prendre de 0 jusqu’à -6. Le résultat sera exprimé en nombre d’UFC par ml de lait. Les résultats d’études réalisées dans des exploitations fermières caprines montraient des contaminations de 10 jusqu’au million d’UFC/ml, mais ce niveau est rarement atteint. 10-5 UFC/ml est déjà un niveau fort. Certaines recommandations sont données en annexe générale pour prélever du lait dans le but de réaliser des analyses microbiologiques.
On cherche à évaluer le pouvoir de contamination de la machine à traire avant la traite et après le nettoyage et la désinfection.
Deux techniques sont possibles, l’une par passage d’eau stérile, l’autre par passage de lait UHT. C’est cette dernière qui est présentée ici.
Le but est d’établir le pouvoir contaminant de la machine à traire par la récupération des Pseudomonas libérés pendant le passage de lait UHT à travers l’installation.
L’avantage du lait stérile est qu’il est possible de l’acheter facilement (dans n’importe quel(le) épicerie ou supermarché). L’autre avantage est de pouvoir le verser dans les manchons trayeurs en simulant une traite.
Description de la méthode : Avant la pose des faisceaux (pulsateurs en marche) et sans avoir rincé la machine, verser 10 litres de lait UHT (pack de lait écrémé à bouchon vissé de 12 mm de diamètre) dans les manchons dont la collerette a été préalablement frottés à l’alcool 70°. Le lait est versé, directement à partir des packs à ouverture par bouchon, dans les manchons situés au bout du circuit de la machine à traire (2 manchons dans le cas où le lactoduc est linéaire, 4 manchons dans le cas où le lactoduc forme un Y). Les packs de lait sont placés, un à un, verticalement, le bouchon vers le bas pour accélérer l’écoulement. Le lait est récupéré en bout de la canne de vidange dans un récipient stérile. Sur 10 litres, seulement 4 litres de lait sont en général récupérés.
Après les opérations de nettoyage et de désinfection, recommencer la même méthode avec 10 litres de lait UHT.
Remarque : Les résultats sont exprimés par UFC par ml. Il faut faire attention à l’interprétation des résultats. Par exemple, il n’est pas possible de comparer les résultats avec des dénombrements de flore totale obtenus dans le cadre du paiement du lait. En effet, c’est dans la méthode décrite ici un petit volume de lait qui est passé dans la machine, pour chercher à récupérer, "décrocher" des germes. En revanche, il est possible de comparer les résultats entre les fermes d’une même étude.
Pour repérer alors les pratiques à risque, il est nécessaire de :
Assister à la traite et aux opérations de nettoyage/désinfection permet de détecter certaines pratiques à risque.
Pour avoir plus d’informations sur les données à relever, consultez les fiches "Nettoyage" et "Désinfection", la fiche "Un outil pour vérifier l’efficacité du nettoyage de la machine à traire" et la fiche "Contrôle des paramètres de la MAT".
Le but est de récupérer une partie du biofilm résident sur les parois intérieures des moules, des bacs de caillages, du tank... en contact avec le lait ou les fromages.
Protocole pour les moules : Avec une chiffonnette stérile, frotter la paroi intérieure de cinq moules et ceci sans changer de chiffonnette. Il a été observé que la contamination des moules était hétérogène. Cette technique permet alors de mettre en évidence plus facilement la contamination des moules. Si le budget le permet, il est possible aussi de prélever individuellement les 5 moules pris strictement au hasard. Les résultats sont exprimés en UFC par moules.
Protocole pour les tanks et bacs de caillage : La méthode consiste à frotter la paroi avec une chiffonnette stérile, dans un gabarit calibré à 100 cm². Les résultats sont exprimés par 100 cm² de paroi. Il est ainsi possible d’écouvillonner d’autres matériels en contact avec le lait ou les fromages.
Cette analyse n’est pas à faire en priorité.
Protocole :
préparer au minimum 2 boites de pétri pour l’analyse des aérocontaminations d’un endroit donné (ex : salle de traite) un jour avant les essais
poser délicatement les boîtes à l’endroit testé (éviter tout déplacement d’air) et les ouvrir
laisser les boîtes ouvertes pendant 1 heure
refermer
incuber les boites à 20°C pendant 5 jours
Lecture : les Pseudomonas donnent des colonies vert-jaune fluo. On fera également les tests de confirmation.
Ce sont des séries de tests qu’il est possible de réaliser à la ferme.
Les tests sont basés sur l’apparition de la coloration jaune. La coloration jaune est le signe de la présence de germes. S’il n’y a pas de coloration, cela ne veut pas dire cependant qu’il n’ y a pas de germes. Il peut y avoir des Pseudomonas mais qui n’ont pas secrété de pigments fluorescents (pyoverdine). Dans les fabrications lactiques, il est fréquent que P. fluorescens provoque de l’amertume sans coloration jaune.
Le filtre de la machine à traire va concentrer sur une petite surface les Pseudomonas.
Procédure : retirer le filtre puis le mettre dans un sachet plastique sans le fermer hermétiquement, le laisser à température ambiante et laisser incuber 4 jours pour voir apparaître la coloration jaune.
Grille de lecture : négatif +, douteux +/-, positif +.
Le but est de permettre à Pseudomonas de s’exprimer en surface des fromages en le favorisant par une température froide. Cela permet aux producteurs vendant leurs fromages en blanc à l’affineur de voir comment peuvent évoluer leurs fromages.
Procédure : mettre les fromages dans une boite en PE fermée non étanche et la placer au froid (8-14°C). Les témoins non contaminés bleuissent alors que les fromages contaminés jaunissent.
Grille de lecture : négatif +, douteux +/-, positif +.